Personalisierte Adipositas-Prävention PAP-MV2022   
     
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  02/2018  
  PAP-MV2022 Arbeitspaket  
 

Arbeitspaket 3 - Charakterisierung phänotyp-spezifischer iPS-Zellen

Mit Unterstützung von Herrn Prof. Schambach (MHH Hannover) werden 10 iPSC Zellmodelle von übergewichtigen (n=7) und untergewichtigen Probanden (N=3) etabliert (LOI im Anhang), die aufgrund von Hauptkomponentenanalysen anamnestischer, klinischer und klinisch-chemischer Daten ausgewählt werden. Zur Auswahl stehen vorrangig Patienten mit familiärer genetischer Prädisposition für metabolische Entgleisungen. IPSC Zellmodelle werden umfassend in AP3 und in AP8 genombasierend funktionell charakterisiert werden. Mit dem Seahorse-Verfahren werden am FBN Stoffwechselwege beider IPSC Gruppen funktionell erfasst und vergleichend analysiert. In AP3 wird der Stoffwechsel in IPSC differenzierten Adipozyten, bzw. in AP4 (Dr. Andressen) in differenzierten neuralen Zellen untersucht. Beide Differenzierungsvorgänge dienen dazu funktionelle phänotypische Unterschiede in den iPSC Zellmodellen zu definieren, die möglicherweise mit Unterschieden der BMI Subgruppen assoziiert sein könnten.

 

Ziele: Ziel ist es basierend auf Phänotyp spezifischen, induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zelluläre Modelle für die Aufklärung molekularer Prozesse bei der Entstehung von Adipositas zu etablieren. Mit der Herstellung von Phänotyp spezifischen iPS Zellen (HRO iPSC Modell) werden die Genome der betroffenen Patienten/Probanden in ihrer Vollständigkeit und Funktionalität konserviert. Diese Zellmodelle dienen der funktionellen Analyse molekularer Prozesse auf der Ebene der Genregulation und des Intermediärstoffwechsels. Die HRO iPSC-Zellmodelle ermöglichen umfangreiche vergleichende physiologische, genetische und epigenetische Analysen an differenzierten und undifferenzierten iPS Zellen von adipösen und nicht-adipösen Probanden Welche BMI assoziierten Merkmale die phänotypisch zu charakterisierenden iPS Zellen aufweisen, wird eine zentrale Frage sein.

 

T3.1 - Maßnahme 1: Herstellung von iPS-Zellen

Monat 1-18

In Kooperation mit AP1 und AP2 werden von den adipösen Schwangeren und den Adipösen, die die Adipositas-Sprechstunde von Herrn Prof. Schober in der Klinik Südstadt Rostock aufsuchen, möglichst Patienten mit einem BMI von über 40, sowie Untergewichtige (Geschlecht weiblich) mit einem BMI von unter 20 um eine Zellspende gebeten. Hierzu werden schriftliche Einverständniserklärungen eingeholt, dass unter Wahrung der Anonymität iPS Zellmodelle hergestellt und deren Genome analysiert werden dürfen. Entsprechende Ethikanträge werden zeitnah bis zum Projektbeginn gestellt sein. Arbeitspaket AP2 übernimmt entsprechende Fragebogenbefragungen. Die generelle Akzeptanz genombasierter Analysen zur Adipositas-Prävention wird bestimmt. Die iPS Zellen werden in Kooperation von Herrn Prof. Schambach in Hannover erstellt.

 

M3.1 Meilenstein 1: Erstellung von bis maximal 10 iPSC-Zellmodellen

Es werden mit Hilfe von AP2 die Probanden in AP1 ermittelt, die bereit sind, einer Zellspende zuzustimmen und ihre Erlaubnis erklären, dass die Genome dieser iPSC vollständig sequenziert und analysiert werden dürfen. Wichtig ist für die wissenschaftliche community, dass diese iPSC Zellmodelle prinzipiell über die

Projektlaufzeit hinaus benutzt werden dürfen. Die PBMC werden dann in Hannover zu iPSC reprogrammiert. Der Transfer nach Rostock erfolgt umgehend, nachdem eine initiale Validierung der iPSC Modelle an der MHH in Hannover erfolgt ist. Erfolgreicher Abschluss des Meilensteines erfolgt dann, wenn bis zu maximal 10 Zellmodelle erstellt worden sind.

 

Monat 18

 

D3.1 Ergebnis1: iPSC Zellmodelle wurden erstellt

 

Nach 18 Monaten Projektlaufzeit stehen die iPSC Zellmodelle zur Verfügung.

 

Monat 18

 

 

T3.2 - Maßnahme 2: Primäre Charakterisierung von iPS Zellmodellen

Monat 12-30

Nach einer Validierungsphase in Hannover werden die iPSC Zellmodelle dann auf Genom- (P1), Transkriptom- (P1), Proteom- (P6) und Metabolom-Ebene (P4) charakterisiert. Seahorse-und Metabolom-Messungen werden von P4 am FBN durchgeführt. Insbesondere werden SNPs, DNA Methylierungsmuster und weitere genomische Unterschiede zwischen den iPSC adipöser und untergewichtiger Probanden ermittelt. Die Whole Genome Sequenzierung (WGS) wird extern vergeben.

WGS Daten sowie bisherige Erkenntnisse aus GWAS Studien werden in die bioinformatisch gesteuerte funktionelle Analyse integriert (AP8). Ein Augenmerk wird u.a. auf die funktionelle Charakterisierung von SNPs gelegt, die mit Schwangerschafts-Komplikationen assoziiert sein sollen (AP1).

 

M3.2 Meilenstein 2: Phänotypen primärer iPSC Modelle erstellt

In Zusammenarbeit mit AP8 werden die Genome der iPSC Zellmodelle vergleichend analysiert, bzw. funktionelle Studien von Stoffwechselwegen durchgeführt. Bestimmung von funktionellen Unterschieden im Stoffwechsel zwischen den iPSC Zellmodellen und deren Korrelation mit epi-/genetischen Markierungen.

 

Monat 30

 

D3.2 Ergebnis 2: Phänotypische primäre iPSC Charakterisierung erfolgte

Die molekulare und funktionelle Charakterisierung der iPSC Zellmodelle beantwortet die Frage, ob iPSC Zellmodelle sich im speziellen in der Adipositas-Forschung, bzw. im allgemeinen zum Studium polygener Erkrankungen genutzt werden können.

 

Monat 30

 

T3.3 Maßnahme 3: Proteom-Analyse der iPSC Zellmodelle

Monat 18-42

Das Proteom-Zentrum Rostock (Leitung P6) übernimmt die massenspektrometrische Charakterisierung der iPSC Zellmodelle, bzw. die Charakterisierung möglicher HAP1 Validierungsmodelle. Der Doktorand, der in A3 mit VK 0,25 arbeitet, wird auch die massenspektrometrische Charakterisierungen in Personalunion durchführen. Er ist deshalb auch mit VK 0.25 Herrn Prof. Glocker mit P6 zugeordnet worden.

 

M3.3 Meilenstein 3: Phänotyp-Charakterisierung der iPSC abgeleiteten Adipozyten

Die iPSC Zellmodelle werden in weißes und braunes Fettgewebe differenziert und dann funktionell charakterisiert. Einsatz Hierzu werden Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Messungen (FBN) durchgeführt und mit Unterstützung von AP8 ausgewertet. Gleichzeitig stellt P2 Fettgewebe als Vergleichsgewebe zur Verfügung, welches bei der Durchführung von Kaiserschnittentbindungen bei Sectioindikation anfällt, so dass hier Vergleichsmessungen ermöglicht werden, insbesondere wenn zuvor von dem Spender auch entsprechende iPSC Zellmodelle erstellt worden sind.

 

Monat 42

 

 

D3.3 Ergebnis 3: Adipozyten aus iPSC generiert

 

iPS Zellen werden mit dem Ziel differenziert, weißes und braunes Fettgewebe zu erzeugen, um dann zu prüfen, ob es Phänotyp-assoziierte Merkmale in den iPS Zellen gibt, die sich mit einem BMI von über 30 bzw. von unter 20 korrelieren lassen.

 

Monat 42

 

T3.4- Maßnahme 4: Validierungen im HAP1 System

Monat 24-42

Die Arbeitsgruppe Prof. Thiesen arbeitet seit Jahren mit dem HAP1 System um molekulare Mechanismen der epi-/genetischen Genregulation aufzuklären. Es wurden Substanzen identifiziert, die in den Zell-Stoffwechsel eingreifen. Diese Substanzen dienen der Perturbationen von Stoffwechselprozessen in vergleichenden Seahorse-Messungen, um bestehende Unterschiede prägnanter herausarbeiten zu können (Masterarbeit: Bernert A.) . Diese Unterschiede können dann im HAP1-System über gezielte Genknockout-Studien gekoppelt mit Transkriptom- und funktionellen Studien validiert werden. Um Funktionalitäten von Genen aufzuklären, die sich aus den vergleichenden funktionellen IPSC Studien ergeben, werden somit entsprechende HAP1 Gene-Knockout-Modelle analysiert.

 

M3.4 Meilenstein 4: Hap1 Knockout-Modelle sind erstellt und charakterisiert

Transkriptom, Proteom, Metabolom

Monat 40

D3.4 Ergebnis 4: iPSC Merkmale in HAP1 analysiert

Die Ergebnisse aus dem HAP1 System sollen in die finale Schlussbewertung der epi-/genetischen Daten einfließen, die in A8 final ermittelt werden.

 

Monat 40

 

 

T3.5 Maßnahme5: Proteom-Analyse der iPSC Zellmodelle

Monat 18-40

Das Proteom-Zentrum Rostock (Leitung P6) übernimmt die massenspektrometrische Charakterisierung der iPSC Zellmodelle, bzw. die Charakterisierung möglicher HAP1

Validierungsmodelle. Der Doktorand, der in A3 mit VK 0,25 arbeitet, wird auch die

massenspektrometrische Charakterisierungen in Personalunion durchführen. Er ist

deshalb auch mit VK 0.25 Herrn Prof. Glocker mit P6 zugeordnet worden.

M3.5 Meilenstein 5: Differentielle iPSC Proteinexpressionen

Mittels massenspektrometrischer Proteinanalytik wird untersucht, ob es auf Proteinebene Hinweise gibt, ob iPS Zellen von übergewichtigen und untergewichtigen Probanden unterschiedliche Proteinexpressionen zeigen. Insbesondere werden differentiell exprimierte Proteine analysiert, die mit dem Stoffwechsel assoziiert sind, bzw. die als mögliche Kandidatenproteine aufgrund assoziierter Transkriptom-Analysen bzw. assoziierter DNA Methylierungsmuster bestimmbar sein könnten.

 

Monat 40

 

 

D3.5 Ergebnis 5: Differentielle iPSC Proteinsignaturen

Es liegen Listen differentiell exprimierter Proteine vor, die an A8 zur weiteren Auswertung übergeben werden.

 

Monat 40