Personalisierte Adipositas-Prävention PAP-MV2022   
     
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  02/2018  
  PAP-MV2022 Arbeitspaket  
 

Arbeitspaket 4 - Stoffwechsel neural differenzierter Stammzellen

Basierend auf einem im Labor etablierten Protokoll zur Selektion neuraler Vorläuferzellen aus iPS-Zellen sollen in einem ersten Schritt Hinweise auf vermutete spenderspezifische Unterschiede hinsichtlich der positiven Selektion neuraler Vorläuferzellen unter Verwendung von Wachstumsfaktoren validiert werden (Maßnahme 1) und ihre mögliche Bedeutung für die anschließende Differenzierung zu zentralnervösen Nervenzellen sowie Gliazellen untersucht werden (Maßnahme 2).

Methodisch werden dabei Genexpressionsanalysen, epigenetisch bedingte Veränderungen der Genexpression, in vitro Messungen metabolischer Parameter (seahorse Verfahren) sowie immunzytochemische und molekularbiologische Bestimmung von Proliferations- und Apoptose- sowie Differenzierungsmarkern Verwendung finden.

 

 

Ziele: Es wird die Bedeutung des Stoffwechsels auf Proliferation neuraler Stammzellen und ihrer Differenzierung zu Nervenzellen und Gliazellen untersucht (de Lucia et al. 2017). Dieser Einfluss wird in Zusammenhang mit vermuteten veränderten metabolischen Eigenschaften neuraler Stammzellen aus iPS Zellen der verschiedenen Spender (BMI>40 im Vergleich zu BMI<20) herausgearbeitet. Immuncytochemische und molekularbiologische Untersuchungen dienen dem Nachweis von Proliferation und Apoptose der Stammzellen (MS1) sowie deren Differenzierungsverhalten in Richtung Neuro- und Gliogenese (MS2). Zum Nachweis eines Einflusses des Zellmetabolismus auf Stammzellproliferation und -differenzierung werden biochemisch-metabolische Untersuchungen (AP7) durchgeführt. Ein epigenetisch bedingter Einfluss auf eine veränderte metabolischen Ausstattung der Zellen erfolgt durch Analyse des Epigenoms sowie Transkriptoms (AP3). doi: 10.3389/fphys.2017.00017

 

 

T4.1 - Maßnahme 1: Proliferation personalisierter neuraler Stammzellen

Monat 1-24

Die Wachstumsfaktor-induzierte Selektion (hier IGF, EGF und bFGF) neuraler Stammzellen der verschiedenen Probanden wird hinsichtlich der Proliferation und Apoptose durch Nachweise entsprechender immunzytochemischer Marker analysiert.

Dabei werden quantitative Untersuchungen zum Wachstum neuraler Stammzellen unter Zugabe von Wachstumsfaktoren (einzeln und in Kombination) durchgeführt. Die Ergebnisse sollen zur weiteren Analyse zugrundeliegender molekularer Mechanismen qualitativ bestätigt und beobachtete Unterschiede evaluiert werden. Anschließend wird an ausgesuchten neuralen Stammzellen unterschiedlicher Spender das Proliferationsverhalten mit den Ergebnissen zur Transkriptomanalyse korreliert. Dies geschieht mithilfe von Genexpressionsanalysen, um so den Beitrag differentiell regulierter Signalwege für die Proliferation der neuralen Stammzellen herauszuarbeiten. Diese Ergebnisse werden mit denen zur Untersuchung spezifischer epigentischer Modifikationen des Genoms der Probanden verglichen und auf ihre Bedeutung für genregulatorische Vorgänge evaluiert.

Die daraus abzuleitenden stoffwechsel-bezogenen Daten werden durch die Untersuchungen zum metabolischen Verhalten im Seahorse Experiment ergänzt.

 

M4.1 Meilenstein 1: Daten zum Proliferationsverhalten neuraler Stammzellen

Erfassung quantitativer und qualitativer (immunzytochemischer) Daten zum Proliferationsverhalten neuraler Stammzellen nach einer ca. 3-5 wöchigen Selektion/Proliferation.

 

Monat 9

 

 

M4.2 Meilenstein 2: Bedeutung der verwendeten Wachstumsfaktoren

Korrelation des Proliferationsverhaltens neuraler Stammzellen mit expressionsanalytischen Ergebnissen (Affymetrix) zur Bedeutung der verwendeten Wachstumsfaktoren (in Zusammenarbeit mit P1).

 

Monat 12

 

M4.3 Meilenstein 3: Epigenetische Ursachen der Transkriptionsaktivierung

Herausarbeiten epigenetisch bedingte Ursachen für differentielle Aktivierung der Transkription durch Wachstumsfaktoren.

 

Monat 15

 

M4.4 Meilenstein 4: Abschluss der Seahorse-Experimente

Korrelation erwarteter spenderabhängiger Unterschiede der metabolischen Aktivität neuraler Stammzellen im Seahorse Experiment mit den Befunden zu epigenetisch bedingten Veränderungen von Proliferationsverhalten bzw. zur Transkriptomanalyse (in Zusammenarbeit mit der AG Prof. Wimmer).

 

Monat 18

 

D4.1 Ergebnis 1: Synopsis von Epigenom, Transcriptom und Metabolom

Nachweis epigenetisch bedingter Unterschiede von morphologischen, Transcriptom assoziierten und metabolischen Parametern während der Proliferation neuraler Stamm-/Vorläuferzellen.

 

Monat 24

 

T4.2 Maßnahme 2: Neuro- und Gliazellgenese

Monat 18 - 42

Der Einfluss induktiver Wirkungsmechanismen der Proliferationsphase wird in Bezug auf das anschließende Differenzierungsverhalten neuraler Stammzellen durch Einsatz entsprechender immuncytochemischer Marker für neuronale (z.B. ßIII Tubulin) und gliale Differenzierung und Korrelation zu Signalwegen auf mRNA Ebene

herausgearbeitet.

Es werden wiederum immuncytochemische, molekularbiologische RNA Expressionsanalysen und epigenetische Veränderungen des Genoms (beide in Zusammenarbeit mit P1) und metabolische (Zusammenarbeit mit P4) Auswertungen durchgeführt. Als funktionelles "read out" möglicher spezifischer Effekte dienen die Quantifizierung morphologischer und neurochemischer Unterschiede einer neuronalen Differenzierung über immunzytochemische Marker (Anzahl der Nervenzellen, Morphologie der Verzweigungen und Anzahl der Fortsätze, Transmitterausstattung) im Vergleich zu einem unbehandelten Kontrollansatz sowie damit korrelierende Unterschiede im Transkriptom, Epigenom und Metabolom, der Zellen.

Nach einer bis zu ca. bis 8 wöchigen Differenzierung neuraler Stammzellen werden zunächst wiederum quantitative Daten über morphometrische Verfahren erhoben. Dazu werden sowohl Zahl als auch Morphologie neuronaler und glialer Zellen erfasst. Die Erfassung beteiligter Signalwege erfolgt durch Transkriptomanalyse während ausgesuchter Zeitpunkte dieser Differenzierungsphase. Erwartete Unterschiede der quantitativen und qualitativen/morphologischer Untersuchungen sowie der zum Transkriptom zwischen den verwendeten Stammzellen unterschiedlicher Spender sollen mit epigenetischen Veränderungen des Genoms korreliert werden.

 

 

M4.5 Meilenstein 5: Unterschiede im Differenzierungsverhalten der Spenderzellen

 

Erfassen quantitativer und qualitativer/morphologischer Unterschiede im Differenzierungsverhalten der Spenderzellen.

 

Monat 24

 

M4.6 Meilenstein 6: Signalweg differenzierender neuraler Stammzellen

 

Korrelation mit den Befunden der expressionsanalytische Untersuchungen (Affimetrix). Schwerpunkt dabei stellen mögliche Veränderungen im Signalweg differenzierender neuraler Stammzellen in den verschiedenen Ansätzen dar.

 

Monat 33

 

M4.7 Meilenstein 7: Epigenetisch bedingte Unterschiede

 

Das Aufzeigen beteiligter Signalwege bei spenderspezifischen Unterschieden in Hinblick auf epigenetisch bedingte Ursachen.

 

 

Monat 36

 

 

M4.8 Meilenstein 8: Auswertung der Seahorse-Experimente

 

Nachweis spenderspezifischer Veränderungen der metabolischen Aktivitäten der Nervenzellen durch entsprechende funktionelle Untersuchungen im "Seahorse" Experiment.

 

Monat 42

 

 

D4.2 Ergebnis 2: Synopsis von Epigenom, Transcriptom und Metabolom

 

Nachweis epigenetisch bedingter Unterschiede von morphologischen, Transkriptom assoziierten und metabolischen Parametern während der neuronalen Differenzierung.

 

Monat 42