Personalisierte Adipositas-Prävention PAP-MV2022   
     
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  02/2018  
  PAP-MV2022 Arbeitspaket  
 

Arbeitspaket 5 - Murine Langzeitselektionsmodelle

Im Laufe von mehr als 150 Generationen der Selektion hat sich in den Mauslinien eine Vielzahl von genetischen Ereignissen akkumuliert, die zum Phänotyp beitragen. Der Selektionsprozess führt zudem zu unterschiedlichen Mustern der epigenetischen Modifikationen (DNA-Methylierung), in den Linien. Dabei tragen epigenetische Modifikationen zum Selektionserfolg bei, indem sie exogene Einflüsse auf der Ebene des Genoms und Transkriptoms vermitteln. Vergleichende Untersuchungen des Genoms, Epigenoms, Transkriptoms der Mausmodelle zeigen, welche genetischen und epigenetischen Unterschiede in welchem Ausmaß zur Differenzierung in Expressionsprofilen und metabolischen Parametern beitragen. Zur diätetischen Auslenkung wird eine "Cafeteria"-Diät mit hohem Isoglukose-Anteil (High Fructose Corn Syrup, HFCS) eingesetzt, die aufgrund der jüngsten Änderungen der EU-Zuckermarktordnung ökonomisch und seiner adipogenen Wirkung medizinisch von hoher Relevanz ist.

 

Ziele: Die Dummerstorfer Langzeitselektionslinien haben durch die Selektion auf Gewichtszunahme bzw. Laufleistung divergente Nährstoff- und Energiestoffwechsel entwickelt, die im Genom und Epigenom manifestiert sind. Sie stellen ein polygenes Modell für Stoffwechseltypen dar. Die Klärung der genetischen und epigenetischen Unterschiede bei den stoffwechseldivergenten Linien sowie ihrer Antwort auf diätetische Auslenkung auf allen Ebenen der Genotyp-Phänotyp-Abbildung dient der Identifizierung von molekularen Pfaden des Nährstoffum/-ansatzes und prädisponierender Faktoren für Adipositas. Ein PostDoc am FBN wird in die Koordinierung des Projekts sowie die Betreuung von 3 Promotionsvorhaben am FBN eingebunden. Dieser PostDoc wird für die Leitung einer Nachwuchsgruppe "Epigenetics and Fetal Programming", die am FBN ab Monat 37 eingerichtet wird, qualifiziert und zur Habilitation geführt. In AP5 wird eine Doktorandin mit einer kumulativen Dissertation qualifiziert.

 

 

T5.1 - Maßnahme 1: (Epi-)genetische und metabolische Spuren der Selektion

 

Monat 7-12

 

Zur Untersuchung der genetischen und epigenetische Divergenz der Langzeitselektionslinien sowie der metabolischen, transkriptomischen und epigenetischen Antwort auf diätetische Auslenkung werden Mäuse der Dummerstorfer Langzeitselektionslinien FztDU (unselektierte Kontrolle) und DU6 ("Adipositasmaus", Selektion auf hohe Körpermasse am Tag 42 > 150 Generationen), sowie DUhLP ("Marathonmaus" Selektion auf hohe Laufleistung > 120 Generationen) ab Tag 29 mit einer Kontroll- bzw. einer experimentellen "Cafeteria-Diät" mit hohem Fett und Maissirup-Anteil ad libitum gefüttert bei linientypischer motorischer Aktivität (n=6/Gruppe; 2x3x6=36; geschlechtsbalanciert, Modell "Diäteffekte"). Futteraufnahme und Körpergewicht werden wöchentlich individuell erfasst, darüber hinaus erfolgen monatliche Blutentnahmen zur Bestimmung klinischer-chemischer und metabolischer Parameter (M6.2). Die Tötung der Tiere erfolgt zum 87. Lebenstag mit Beprobung von Blut, Muskel (M. quadrizeps femoris), viszeralem Fettgewebe und Leber. Genomische Sequenzen der Mauslinien liegen vor; das Epigenom und Transkriptom (mRNA, miRNA) der Leber wird mittels holistischer Methoden (RRBS bzw. RNA-Seq.) sowie gezielter Hochdurchsatztechnik (Fluidigm BiomarkHD) charakterisiert. Die Analyse der Daten zur Identifikation von merkmalsrelevanten molekularen Pfaden, genetischen und epigenetischen Polymorphismen sowie zur Untersuchung der genetischen und epigenetischen Ereignisse während der Selektion erfolgt im Rahmen von AP7.

 

M5.1 Meilenstein 1: Abschluss der Tierexperimente ("Diäteffekte")

 

Zootechnische Parameter und Gewebeproben sind erfasst.

 

Monat 12

 

 

 

T5.2 - Maßnahme 2: Transgenerationelle Vererbung epigenetischer Modifikationen

 

Monat 7-24

 

Die Versorgung von Müttern (F0) beeinflusst die intrauterine Umwelt der Nachkommen (F1) mit Konsequenzen für deren Phänotyp und Epigenotyp. Da auch deren Keimzellen (F2) der intrauterinen Umwelt ausgesetzt sind, sind transgenerationale Konsequenzen der Diät erst in der F3 nachweisbar. Nutritive Faktoren beim Mann (F0) beeinflussen unmittelbar dessen Spermien (F1). Daher zeigt eine F2 transgenerationelle Effekte. Entsprechend wird männlichen und weiblichen F0-Mäusen der drei Linien (n=3/Gruppe; 2x2x3x3=36) eine Kontroll- bzw. "Cafeteria-Diät" beginnend 1 Woche vor der Anpaarung gefüttert. Das Epigenom und Transkriptom der Leber werden in der F1, F2 bzw. F3 (n=6/Gruppe; 2x3x6=72 in väterlicher bzw. mütterlicher Linie) aus einem entsprechende Zuchtschema vergleichend untersucht, um direkte und persistente Effekte und transgenerationelle Vererbung von epigenetischen Modifikationen als Äquivalent des molekularen Gedächtnisses aufzuzeigen (Modell "molekulares Gedächtnis"). Darüber hinaus erfolgt die Erfassung von Wachstums-, metabolischen und klinisch-chemischen Parametern (M 6.2). Die biostatistische und bioinformatische Analyse erfolgt in AP7.

 

M5.2 Meilenstein 2: Abschluss der Tierexperimente ("molekulares Gedächtnis")

 

Zootechnische Parameter und Gewebeproben aus allen Generationen sind erfasst.

 

Monat 24

 

T5.3 - Maßnahme 3: Funktionelle Analysen

 

Monat 25-42

 

Die Tierexperimente liefern eine Reihe von molekularen Routen, in denen genetische Variation oder epigenetische Prägung zur phänotypischen Divergenz der Stoffwechseltypen beitragen. Die Kartierung der Polymorphismen in QTL-Regionen sowie die in-silico funktionelle Annotationen mit öffentlichen Datenbanken (Ensembl Variant Effect Predictor; NCBI; Animal genome Database, (Mouse-)ENCODE) sowie Informationen aus der eigenen Beteiligung am internationalen FAANG (Functional Annotation of Animal Genomes) Konsortium, dient der evidenzbasierten Auswahl von Polymorphismen mit funktioneller Bedeutung und großen zu erwartenden biologischen Auswirkungen. Die Funktionalität wird experimentell validiert durch in-vivo (allelspez. Expression, TF-binding assay, Enzymaktivität, u.a.) und in-vitro (Reporterassay, Gen-Editing, u.a.) Methoden. Dabei ermöglicht CRISPR/Cas9 die Sequenz und Methylierung von Genen in sequentiellen und simultanen Anaylsen entlang eines vollständigen Stoffwechsel- oder Signalwegs zur Funktionsaufklärung zu modifizieren.

 

M5.3 Meilenstein 3: Erstellung der Kandidatenliste

 

Basierend auf multipler experimenteller und in-silico Evidenz für die Funktionalität wird eine Liste von Polymorphismen für funktionelle Analysen erstellt.

 

Monat 32

 

D5.1 Ergebnis 1: (Epi-)genetisch und metabolische Alleinstellungsmerkmale

 

Die Charakterisierung der Langzeitselektionslinien auf allen Ebenen der Genotyp-Phänotyp-Abbildung und ihrer Adaptationsreaktion auf diätetische Auslenkungen zeigt die molekularen Pfade an, die im Laufe der Selektion genetische und epigenetische Ereignisse angehäuft haben und zur Merkmalsdifferenzierung beitragen. Diese stellen Kandidaten für die nachfolgenden Analysen ab. Insbesondere diese im Mausmodell gezeigten Reaktionspfade und potentiellen Biomarker für Stoffwechseltypen werden vergleichend in den humanen IPS-Zellen auf ihren diagnostischen und prädiktiven Wert untersucht, um zur Etablierung des IPSC-Modells beizutragen (AP3, AP8).

 

Monat 32

 

D5.2 Ergebnis 2: Transgenerationale Vererbung epigenetischer Marker

 

Die transgenerationale Vererbung von epigenetischen Modifikationen ist ein viel diskutiertes Phänomen, für das sich in der Literatur zunehmend Belege finden, auch hinsichtlich Adipositas. Allerdings betrachten nur wenige Studien die Filialgenerationen 2 (männliche Linie) bzw. 3 (mütterliche Vererbung). Die Untersuchungen in den Dummerstorfer-Langzeitselektionsmauslinien tragen zur Klärung bei, ob und welche stoffwechsel-assoziierten differentiell methlylierten Cytosinposition transgenerationell vererbt werden. Diese sind in der Humanmedizin bedeutend hinsichtlich der Epidemiologie von Stoffwechselerkrankungen wie Adipositas. Die Kenntnis solcher Position beim Nutztier offenbart neue Werkzeuge für die Züchtung.

 

 

Monat 42