Personalisierte Adipositas-Prävention PAP-MV2022   
     
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  02/2018  
  PAP-MV2022 Arbeitspaket  
 

Arbeitspaket 8 - Charakterisierung der iPSC Zellmodelle

 

Whole Genome Daten der iPSC sollen mit eigenen Whole-Genome-Sequenzierdaten Rostocker Probanden in silico verglichen werden. Im Mittelpunkt der Analyse steht das Ziel, epi- und genetische Marker für HRO IPSC Zelllmodelle der HRO Probanden zu identifizieren, die mit hohen oder niedrigen BMIs einhergehen. In funktionellen Vergleichsstudien werden in AP3 haploide HAP1-Zellmodelle einschließlich entsprechender CRISPR-Cas9 Genknockouts benutzt. HAP1-Zellmodelle wurden bisher von Herrn Dr. Andressen (P4) in neurale Zelltypen differenziert, bzw. in Seahorse-Studien im FBN in Dummerstorf charakterisiert. Die iPS Zellen werden in AP3 zu Adipozyten differenziert, bzw. mit Adipozyten verglichen, die aus dem Fettgewebe der entsprechenden Spendern stammen. Falls möglich, werden auch Adipozyten aus mesenchymalen Stammzellen der Spender differenziert.

 

 

Ziele: Im PAP-MV2022 Projekt wird folgende übergeordnete Frage gestellt: Welche wissenschaftlichen Möglichkeiten ergeben sich durch die Verwendung von iPSC-Zellmodellen in der Adipositas-Forschung. Neben der Bestimmung des Gesamtgenomes, des Transkriptoms und des Proteoms stehen die iPSC Zellmodelle für funktionelle Studien zur Verfügung. Nach Erhalt der iPS Zellen werden die entsprechenden Stoffwechselwege vergleichend analysiert (Seahorse-Experimente mit P4). Über die Verwendung Stoffwechsel aktiver modifizierenden Inhouse-Substanzen in AP3 (P1) werden iPSC Zellen im Rahmen einer vergleichenden Charakterisierung der Phänotypen der HRO iPSC Adipositas-Zellmodellen unter sich und unter Einbindung des HAP1 Zellmodells gezielt pertubiert und bioinformatisch in AP8 analysiert. Eine zentrale Frage ist: Gibt es epi-/genetische und funktionelle Merkmale, die darüber entscheiden, ob die Genome dieser iPSC Zellmodelle zu Adipositas neigen oder nicht.

 

 

T8.1 - Maßnahme 1: Vergleichende Whole Genome Analysen

 

Monat 1-42

Epi-/ Genomdaten und funktionelle Daten werden in der Inhouse-Genomdatenbank der Arbeitsgruppe Prof. H.-J. Thiesen von Herrn Steinbeck eingepflegt und vergleichend analysiert. Es geht um die Frage, welche Unterschiede lassen sich zwischen den IPSC Genomen der IPSC Zellmodelle ermitteln. Die HRO Genome selbst werden extern in Zusammenarbeit mit der Firma BGI ermittelt. Die SNP -Daten werden in einem Inhouse-Verfahren verglichen.

Final sollen die Ergebnisse analog zur Animation des Interferon-Pathways: http://sch197.med.uni-rostock.de/interferon/?new. dargestellt werden.

 

M8.1 Meilenstein 1: Dokumentation epi-/genetischer Varianten

Die Whole Genome Daten werden analysiert analog einer Roadmap, die im Institut für Immunologie für die Auswertung somatischer Genome (Nierenzellkarzinom) entwickelt und für die Analyse von Zinkfinger assoziierten Ciruitries genutzt werden (Manuscript eingereicht). Es ist insbesondere zu prüfen, welche krankheitsrelevanten SNPs in diesen Genomen auftreten. Im Mittelpunkt stehen Stoffwechselwege und Signalwege, die mit der Adipositas direkt bzw. mit deren Komorbiditäten assoziiert sein sollen, siehe auch A1 und A3.

 

Monat 30

 

D8.1 Ergebnis 1: Auflistung von SNPs, Indels und CNA

 

Es wird geprüft, ob die Unterschiede mit den BMI-Werten der Spender korreliert werden können. Insbesondere sind hier die Daten von umfangreichen GWAS-Studien und Daten aus SNPedia in die Analyse zu integrieren.

 

Monat 30

 

T8.2 - Maßnahme 2: Seahorse-Metabolismus-Studien

 

Monat 12-36

Über gezielte Perturbationen der Stoffwechselwege sollen BMI assoziierte Phänotypen in den iPSC Zellmodellen beschrieben werden. Die Arbeitsgruppe Thiesen hat Substanzen identifiziert (Patentschrift WO 2010/040515 A1)., die in den Metabolismus von Stoffwechselwegen eingreifen. Es stellt sich die Frage, ob es Hinweise gibt, ob der Metabolismus dieser iSC Zellen sich im undifferenzierten und/oder im differenzierten Zustand unterscheiden lassen. Es ist zu vermuten, falls Unterschiede auftreten sollten, dass diese Unterschiede durch genetische Unterschiede im Genom verursacht werden, so dass als Folge auch das epigenetische Makeup der Zelle eine Folge der genomischen Unterschiede sein sollten. Wie in AP3 beschrieben, soll das HAP1 System zur Validierung eingesetzt werden.

Referenz: Peter Lorenz, Dirk Koczan, Björn Ziems, Karl Hackmann, Felix Steinbeck, Tilmann Bürckstümmer, Hans-Jürgen Thiesen. Altered gene expression of haploid HAP1 C631 cells in comparison to corresponding diploid C665 cells. The 7th EMBO Meeting. Mannheim 10-13, 2016.

Patentschrift: Verfahren zur Identifizierung genaktivierender Wirkstoffe. Patentschrift WO 2010/040515 A1. Internationale Anmeldung 15. April 2010. Erfinder und Anmelder: H.-J. Thiesen, Institut für Immunologie, Universität Rostock.

Referenzen: Jason D. Arroyo et al., 2016

 

M8.2 Meilenstein 2: HAP1 Validierung von iPSC Spezifika

 

Falls spezifische Gene bzw. Genloci mit der Adipositas assoziiert sein sollten, dann soll geprüft werden, ob diese Modifikationen direkt mit den vermuteten Pathophysiologien assoziiert sein könnten. Das HAP1 System wird in A3 eingesetzt, um über Knockout und Knockin-Studien zu bestimmen, ob eine direkte Assoziation mit der Funktionalität der gefundenen SNPs assoziiert sein könnte.

Referenz: Bernert, Alisa. Characterization of the mechanisms of action of low molecular weight inhibitors of KRAB-mediated transcriptional repression. Masterarbeit Institut für Immunologie im Studiengang Medizinische Biotechnologie, Universitätsmedizin Rostock. Rostock, September 2017.

 

Monat 36

 

D8.2 Ergebnis 2: Validierung iPSC assoziierter Epi-/Genom-Daten

In Zusammenarbeit mit AP3 wird festgelegt, welche Gene Knockouts im Hap1 System generiert und analysiert werden soll.

 

Monat 36

 

T8.3 - Maßnahme 3: Vergleichende Analysen differenzierter iPSC Zellen

 

Monat 24-42

Vergleichende bioinformatische Analysen funktioneller Seahorse Studien, sowie Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Daten geben darüber Auskunft, ob sich iPSC Modelle von übergewichtigen und untergewichtigen Probanden/Patienten strukturell bzw. funktionell unterscheiden lassen.

 

M8.3 Meilenstein 3: Stratifizierung von iPSC Zellmodellen

 

Es wird analysiert, ob die iPSC Zellmodelle sich den BMI-Subgruppen zuordnen lassen.

 

Monat 40

 

D8.3 Ergebnis 3: Finale Aussagen zu den iPSC Zellmodellen

Finale Zusammenstellung: Es werden umfangreiche Aussagen zu den Adipositas assoziierten Genen und den Genen, die mit den assoziierten Komorbiditäten korreliert sein sollen.

 

Monat 42

 

T8.4 - Maßnahme 4: Wertigkeit von iPSC in der Adipositas Forschung

 

Monat 36-42

In M8.4 wird eine finale Aussage getroffen, welche Wertigkeit iPSZellen in der Stratifizierung der Adipositas und polygener Erkrankungen überhaupt einnehmen können.

 

M8.4 Meilenstein 4: Potential der iPSC Zellmodelle erstellt

 

Monat 42

 

D8.4 Ergebnis 4: iPSC Zellmodelle in polygenen Erkrankungen

Es wird dokumentiert, welche Potentiale iPSC Zellmodelle in der Erforschung polygener Erkrankungen haben

können.

 

Monat 42

 

M8.5 Meilenstein 5: Aussagen zur partizipatorischen Adipositas Prävention

Es wird dargestellt, inwieweit psychologische Studien wie Fragebogenaktionen zu einer Verbesserung der Adhärenz zu therapeutischen Maßnahmen führen, wenn diese Maßnahmen ein epi-/genetisches Korrelat haben und somit in die Beratung eines Übergewichtigen nutzbar gemacht werden können.

 

Monat 42

 

 

D8.5 Ergebnis 5: Strategien zur Adipositas-Prävention

 

Es wird eine umfassende Analyse der gesamten klinisch ausgerichteten PAP-MV2022 Ergebnisse erstellt.

 

 

Monat 42